注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
3,5-二甲酰(>99.0%(T))Aurora A/AIK Antibody2-溴-6-三氟甲基吡啶

2,二肼鹽酸鹽(>98.0%(HPLC)(T))Aurora B/AIM1 Antibody1-Boc-甲基-哌啶甲酸

O-硝基芐基羥鹽酸鹽(>99.0%(HPLC),用于高效液相色譜標(biāo)記)Aurora B/AIM1 AntibodyBOC-D-氨酸

氮磺酰肼(>99.0%(HPLC),用于高效液相色譜標(biāo)記)Phospho-c-Abl (Tyr89) (61A6) Rabbit mAb氟--5-甲

7-酰氧基-溴甲基(>98.0%(HPLC)(T),用于高效液相色譜標(biāo))JMJD1B (C6D12) Rabbit mAb2-溴芐

Br-Mmc (=溴甲基-7-甲氧基)(>98.0%(T))IGFBP1 (D4E9T) XP® Rabbit mAbA,A二基Β苦基肼基游離基

溴甲基-7-甲氧基-1,并惡-2-酮(>98.0%(T))IGFBP1 (D4E9T) XP® Rabbit mAb無(wú)水檸檬酸單鈉鹽

DBD-PZ [=(N,N-二甲氨基磺酰基)-7-哌-2,1,并惡二唑](>98.0%(HPLC))Smad2/3 AntibodyN-甲基-氨基吡唑

溴甲基-6,7-二甲氧基(>98.0%(HPLC))Smad2 (L16D3) Mouse mAb2,6-二氨基嘌呤

 DBD-CO-Hz [=(N,N-二甲基氨基磺酰)-7-(N-肼基羰甲基-N-甲基)氨基-2,1,并惡二唑](>98.0%(HPLC))

Phospho-Smad2 (Ser245/250/255) Antibody溴-甲氧基

NBD-CO-Hz [=(N-肼羰甲基-N-甲氨基)-7-硝基-2,1,并惡二唑](>95.0%(HPLC))Di-Methyl-Histone H3 (Lys9) (D85B4) XP® Rabbit mAb (PE Conjuga)溴-甲氧基

DBD-ED [=(N,N-二甲氨基磺酰)-7-(2-氨基基氨基)-2,1,并惡二唑]PKM1/2 (C5E6) Rabbit mAb氟-2-甲氧基

AABD-SH (=酰氨基-7-巰基-2,1,并惡二唑](>94.0%(HPLC))Phospho-Smad2 (Ser465/467) (138D4) Rabbit mAbD-(+)-二對(duì)甲氧基甲酰

9-(溴甲基)丫啶(>98.0%(HPLC)(T))Phospho-Smad2 (Ser465/467) (138D4) Rabbit mAb3,4,5-*氧基甲酸甲酯

DBD-COCl [=(N,N-二甲基氨磺酰)-7-(N-甲酰甲基-N-甲氨基)-2,1,并惡二唑](>98.0%(T))Phospho-Smad2 (Ser465/467) (138D4) Rabbit mAb3,5-二甲氧基

NBD-COCl [=(N-甲酰甲基-N-甲氨基)-7-硝基-2,1,并惡二唑](>92.0%(T))SimpleChIP® Human MRPL36 Promor Primers麥草畏

DBD-NCS [=(N,N-二甲基氨磺酰)-7-異硫酸基-2,1,并惡二唑]IFN-α (6B18) Mouse mAb2-噻吩酸

甲酸-9-芴甲酯(>97.0%(HPLC)(T))Phospho-VASP (Ser157) Antibody-2-基吡啶

雞核因子κB受體活化因子(RANK)ELISA試劑盒PDK1/PDPK1  3酸肌醇依賴性蛋白激酶1100 ul

雞核因子-κB(NF-κB)ELISA試劑盒Phospho-PDK1 (Ser241)  酸化3酸肌醇依賴性蛋白激酶1100 ul

雞過(guò)氧化物酶體增殖因子活化受體γ(PPAR-γ)ELISA ELISA試劑盒Phospho-PDK1 (Tyr373/376)  酸化3酸肌醇依賴性蛋白激酶1100 ul

雞過(guò)氧化物酶體增殖因子活化受體B(PPAR-B)ELISA試劑盒Pdk4  丙酮酸脫氫酶激酶420 ul

雞過(guò)氧化物酶體增殖因子活化受體A(PPAR-A)ELISA試劑盒PDX1  胰十二指腸同源異型盒基因100 ul

雞過(guò)氧化氫酶ELISA試劑盒PEA3  瘤促活化因子3100 ul

雞谷胱甘肽過(guò)氧化物酶8(GPX-8)ELISA試劑盒Pectinesrase  果膠酶100 ul

雞弓形蟲循環(huán)抗原(TCA)ELISA試劑盒PEA15  星形膠質(zhì)細(xì)胞PEA15100 ul

雞睪酮(T)ELISA試劑盒Phospho-PEA15 (Ser104)  酸化星形膠質(zhì)細(xì)胞PEA15100 ul
玉米MONPCR檢測(cè)試劑盒規(guī)格甘氨酸受體β/GlyR β抗體Tauroursodeoxycholic acid中文名：牛磺熊去氧膽酸別名：TUDCA; 牛磺熊脫氧膽酸分子式：C26H456S

細(xì)胞核因子GCNF/維甲酸受體相關(guān)受體抗體Lithocholic acid中文名：石膽酸別名：分子式：C24H40O3

G蛋白轉(zhuǎn)錄因子α2/Gα t2抗體Citrostadiel中文名：檸檬二烯醇別名：分子式：C30H50O

脊髓性肌癥蛋白SMA抗體Cyasterone中文名：杯莧甾酮?jiǎng)e名：分子式：C29H44O8

轉(zhuǎn)錄因子Gli2抗體Resibufogenin中文名：脂蟾毒配基別名：分子式：C24H32O4
檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。